Se puede decir que ésta es la última alternativa que puede existir para encontrar espermatozoides. Se realiza una incisión de aproximadamente 1cm en el escroto, desde donde se separan una a una las capas del testículo hasta llegar a la membrana que rodea el tejido del testículo (albugínea), en la que se practica un corte con un bisturí para tomar una pieza de tejido del tamaño de una lenteja. 

La porción del tejido testicular se coloca en una placa con medio de cultivo con pH estable y se introduce a la incubadora. Luego se segmenta la muestra con la ayuda del bisturí y, , a traves de un microscopio invertido se buscan los espermatozoides liberados de los túbulos seminíferos con el microscopio invertido. En el caso de no encontrar espermatozoides, se obtiene otra porción de testículo y, de resultar también negativa, se repite la biopsia en el otro testículo.

Los procedimientos anteriormente descritos pueden llevarse a cabo también en aquellos casos en que más adelante se efectuará un ICSI, para lo cual el tejido obtenido puede congelarse. La biopsia y congelación de tejido testicular ha venido a resolver en gran medida el problema en pacientes con azoospermia no obstructiva y, en el campo de la fertilidad, permite hacer un diagnóstico, sentar un pronóstico para seguir un tratamiento de IVF-ICSI, si encontramos espermatozoides en el tejido.